固定嗜酸性粒细胞与BEAS2B细胞在10 μmol/L SB203580存在情况下联合培养12 h.
 
　　1.2.6细胞培养上清液收集正常或经多聚甲醛固定嗜酸性粒细胞与BEAS2B细胞联合培养到实验设计时间后，收集培养上清液，510 g, 4℃离心10 min，分离无细胞上清液并立即置于-80℃保存.

1.2.7细胞趋化因子测定细胞培养上清液中的细胞趋化因子MCP1应用流式细胞微珠实验（CBA）试剂盒定量（美国BD公司产品）［2］.
 
　　1.2.8BEAS2B细胞总RNA抽提融合的BEAS2B细胞与4×106嗜酸性粒细胞在4 mL含100 mL/L小牛血清的RPMI 1640细胞培养液中联合培养12  h（p38 MAPK抑制剂实验，先加入20 μmol/L SB 203580与BEAS2B细胞培养1 h）. 移去细胞培养液后，BEAS2B细胞用冰育PBS冲洗三次，BEAS2B细胞总RNA用TRIReagent RNA提取试剂盒根据操作说明进行提取. 所提RNA质量通过电泳方法鉴定，分光光度法定量其浓度，于-80℃冰冻保存待用.
 
　　1.2.9RTPCR分析BEAS2B细胞MCP1基因表达细胞总RNA用第一条链cDNA合成试剂反转录到cDNA再行PCR反应. PCR反应混合物为3 mmol/L  MgCl2, 200 μmol/L  dNTPs, 1 单位DNA聚合酶, 50 pmol 5′和3′引物. PCR扩增引物: MCP1 上游5′AATGCCCCAGTCACCTGCTGTTAT3′，下游 5′GCAATTTCCCCAAGTCTCTGTATC3′, 最后的扩增产物为427 bp［3］.  βactin 上游5′AGCGGGAAATCGTGCGTG3′，下游 5′CAGGGTACATGGTGGTGCC3′, 最后的扩增产物为300 bp［4］.  PCR扩增条件： 94℃预变性后，94℃ 1 min, 56℃ 1 min, 72℃ 1 min，共30个循环，最后一个循环后72 ℃延伸10 min. PCR反应在DNA热循环仪中进行.
 
　　统计学处理： 所有实验均重复三次（n=3），嗜酸性粒细胞和BEAS2B细胞联合培养及两种细胞各自培养的上清液中生成MCP1的比较用方差分析，两种细胞在有SB 203580体系中联合培养与不含SB 203580体系中联合培养所释放MCP1的比较用t检验.
　　2结果
　　2.1与嗜酸性粒细胞联合培养对BEAS2B细胞中MCP1基因表达的影响BEAS2B细胞单独培养仅有很少量细胞趋化因子MCP1基因表达, 与嗜酸性粒细胞联合培养12 h后，BEAS2B 细胞中MCP1基因表达显著上调（图1）.
　　BE: BEAS2B 细胞; BE+EOS: BEAS2B细胞和嗜酸性粒细胞联合培养.
 
　　图1与嗜酸性粒细胞联合培养对BEAS2B 细胞MCP1基因表达的诱导作用（略）
　　2.2嗜酸性粒细胞与BEAS2B细胞联合培养对MCP1释放的影响 嗜酸性粒细胞与BEAS2B细胞联合培养12 h，与两种细胞单独培养比较，培养上清液中MCP1释放显著增加［（1266±127) ng/L vs (134±25) ng/L, P<0.001，图2A］. 经多聚甲醛固定后，死亡的嗜酸性粒细胞保持完整的细胞形态和结构，在与BEAS2B细胞联后培养过程中，仍然能够活化BEAS2B细胞释放MCP1 ［（773±48） ng/L vs （107±15） ng/L, P<0.001，图2B］.
　　2.3SB 203580对MCP1释放的影响在嗜酸性粒细胞和BEAS2B细胞联合培养体系中加入p38 MAPK抑制剂SB 203580，两种细胞联合培养上清液中MCP1生成显著下降［（1335±115） ng/L vs （481±42） ng/L, P<0.001，图3A］. 从图3B中可以发现，SB 203580可以抑制多聚甲醛固定的嗜酸性粒细胞刺激BEAS2B细胞释放MCP1 ［（868±89） ng/L vs （239±26） ng/L］.
　　2.4SB 203580对嗜酸性粒细胞诱导BEAS2B细胞MCP1基因表达的影响p38 MAPK抑制剂SB 203580能够有效抑制嗜酸性粒细胞对BEAS2B细胞MCP1基因表达的诱导效应（图4）.
　　BE: BEAS2B细胞; EOS: 嗜酸性粒细胞; EOS*: 多聚甲醛固定的嗜酸性粒细胞; BE+EOS: BEAS2B细胞和嗜酸性粒细胞接触联合培养; BE+EOS*:  BEAS2B细胞和多聚甲醛固定的嗜酸性粒细胞联合培养; bP<0.