g/L, P<0.001］. 结论： 嗜酸性粒细胞可通过p38 MAPK信号传导通路活化支气管上皮细胞表达MCP1，调控过敏性气道炎症反应.
 
　　【关键词】支气管；上皮细胞；嗜酸细胞；单核细胞化学吸引蛋白质1；p38 MAPK
　　0引言
　　过敏性哮喘的显著特点就是大量炎性细胞，特别是嗜酸性粒细胞在支气管炎症部位聚积，活化后的嗜酸性粒细胞可通过脱颗粒释放嗜酸性粒细胞阳性蛋白（ECP）、主要碱性蛋白(MBP)等毒性蛋白，而这些毒性蛋白可造成支气管上皮损伤［1］. 损伤的支气管上皮修复和气道重建可导致气道水肿、增厚、狭窄和对不同刺激的反应性增高，从而引发常见的咳嗽、呼吸困难等一系列临床症状. 支管上皮对外环境的屏障功能已被广泛认识，但作为哮喘炎症反应的发生部位，其在过敏性哮喘发生、发展中的免疫调控作用未能引起广泛重视. 我们通过嗜酸粒细胞与支气管上皮细胞接触培养为实验模型，探讨哮喘过程中嗜酸粒细胞从外周血移行至支气管上皮后，通过活化支气管上皮释放炎性介质细胞趋化因子MCP1，调控过敏性哮喘炎性反应的过程.
　　1材料和方法
　　1.1材料密度1.082 kg/L Percoll溶液: 混合87.92 mL Percoll原液(密度1.130, 瑞典Amersham公司产品)，15 mL 1.5 mol/L NaCl和47.1 mL去离子水；抗CD16抗体磁珠和细胞磁性分离系统（MACS）购自德国Miltenyi Biotec公司；p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）抑制剂SB 203580购自美国Calbiochem 公司；DMEM/F12，RPMI 1640细胞培养液购自美国Gibco Invitrogen公司；RNA抽提试剂TRIReagent购自美国Molecular Research Center公司；人细胞趋化因子CBA测定试剂盒购自美国BD公司；第一条链cDNA合成试剂盒购自瑞典Amersham 公司；MCP1和βactin PCR扩增引物为美国Invitrogen公司产品；流式细胞仪（FACSCalibur）为美国BD 公司产品；DNA热循环仪（PTC200）为美国MJ公司；新鲜人全血由香港红十字会输血服务中心提供.
 
　　1.2方法
　　1.2.1嗜酸性粒细胞分离新鲜人全血中血细胞通过密度为1.082 kg/L Percoll溶液离心分层，去除淋巴细胞层后用冰浴去离子水裂解红细胞，所剩嗜中性、酸性粒细胞与抗CD16抗体磁珠反应使细胞表面带有CD16蛋白质的嗜中性粒细胞与磁珠结合. 当嗜中性、酸性粒细胞混悬液通过磁性分离柱时，由于磁性作用使结合在磁珠上的嗜中性粒细胞吸附于分离柱上，而表面不表达CD16的嗜酸性粒细胞则可以顺利通过分离柱. 分离后的嗜酸性粒细胞用伊红染色鉴定其纯度，计数并调整到适当浓度，再悬浮于含100 mL/L小牛血清的RPMI 1640细胞培养液中待用.
 
　　1.2.2嗜酸性粒细胞固定分离后的嗜酸性粒细胞用10 g/L多聚甲醛在室温中固定3 h，再用含20 mL/L小牛血清的PBS清洗3遍，计数并调整到适当浓度，再悬浮于含100 mL/L小牛血清的RPMI 1640细胞培养液中待用.
 
　　1.2.3细胞培养人支气管上皮细胞系（BEAS2B，美国ATCC公司购买）置含100 mL/L小牛血清的DMEM/F12细胞培养液中，37℃, 50 mL/L CO2孵育.
 
　　1.2.4MCP1释放试验BEAS2B细胞被培养在24孔组织培养板中，待细胞贴壁生长到形成单层后，移净原培养液并立即加入1 mL含1×109/L正常或经多聚甲醛固定嗜酸性粒细胞的（事先加入100 mL/L小牛血清）RPMI 1640细胞培养液，嗜酸性粒细胞与BEAS2B细胞联合培养12 h.
 
　　1.2.5p38 MAPK抑制剂干预实验BEAS2B细胞被培养在24孔组织培养板中，待细胞贴壁生长到形成单层后，弃原培养液并立即加入含100 mL/L 小牛血清的RPMI 1640细胞培养液0.5 mL，然后加入20 μmol/L SB 203580培养1 h，再加入含2×109/L正常或经多聚甲醛固定嗜酸性粒细胞的（事先加入100 mL/L 小牛血清）RPMI 1640细胞培养液0.5 mL. 1×106正常或经多聚甲醛