合成2种地高辛标记探针，用于区分fRNA和trRNA［10］. 在这些PCR反应中，Dig11dUTP部分取代了dTTP作为Taq多聚酶的底物. 各种核苷的使用浓度为：200 μmol/L dATP, dGTP, dCTP; 180 μmol/L dTTP和20 μmol/L DIG11dUTP. 地高辛标记探针的合成严格按照产品说明书进行（Roche, Cat.No.1093088）. 作为分析血清RNA的PCR扩增产物，DIG11dU/dT的最佳比例为1∶10. 地高辛标记探针的显影，采用一种碱性磷酸酶链接的抗地高辛抗体，当碱性磷酸酶与底物BCIP结合后， 其产物可进一步与NBT反应，在膜上产生持久的蓝色或棕色的沉淀.
　　2结果
　　2.1母亲和新生儿血清中HBV DNA， fRNA(全长型) trRNA(顿挫型)的检测图1所示为4对治疗组母亲新生儿血清中相应的PCR和RTPCR扩增结果［10］. 第1和第2对的母亲DNA，fRNA，trRNA和HBeAg阳性， 第3对的母亲仅DNA和trRNA阳性，第4对的母亲仅trRNA阳性. 而所有4名新生儿仅显示trRNA阳性.
　　2.2治疗组与非治疗组母亲和新生儿血清病毒RNA和DNA检测结果表1总结了治疗组与非治疗组母亲和新生儿血清中HBV DNA，fRNA和trRNA检测结果. HBV DNA和fRNA等病毒复制的指标仅存在于非治疗组新生儿，而trRNA在治疗组与非治疗组新生儿中普遍存在. 未治疗组新生儿HBV DNA和fRNA阳性率明显高于治疗组新生儿（P<0.01），而两组新生儿血清trRNA阳性率无显著性差异（P>0.05）.
　　图中所示119 bp PCR扩增产物为HBV XDNA， 360 bp和235 bp分别为fRNA和trRNA扩增产物. m1n1到m4n4表示4对母亲/新生儿. cDNA f和cDNA tr： 包含f cDNA和trcDNA的阳性对照质粒；符号“-”表示阴性对照；M： 100 bp DNA标志物.
　　图14对母亲/新生儿血清中HBV核酸检测的代表性结果（略）
　　表1HBsAg阳性母亲及其新生儿血清中HBV核酸的检测结果（略）
　　2.3HBIG免疫阻断治疗对trRNA和fRNA的影响表2对比了仅仅trRNA阳性和fRNA与trRNA共同阳性新生儿的例数. 未治疗23位母亲所生23名新生儿中，12名表现为仅trRNA阳性，而治疗组46位母亲所生新生儿全部表现为仅trRNA阳性（表2）. 结果提示，单独trRNA阳性新生儿的出现与免疫治疗无关，免疫治疗导致新生儿fRNA消失，相应地trRNA单独阳性的例数增加. 在HBsAg和HBeAg共同阳性母亲所生的新生儿中，免疫治疗导致新生儿单独trRNA阳性例数相对增加的作用表现得更加明显（表2）. 未治疗母亲所生新生儿中，fRNA和trRNA共同阳性者占7/11， 而在治疗组中则为0/14.
3讨论
　　本研究立足于应用血清HBV RNA和DNA区分新生儿的不同感染类型. 既往研究表明，fRNA是一个病毒复制的标志物，而trRNA单独阳性提示无复制阶段的病毒基因表达［8,9,14］. 先前基于肝组织和血清的研究提示，trRNA的来源与染色体整合的和游离的病毒DNA均有一定关系［14-15］. 而新生儿的感染处于病毒感染的早期阶段，此时染色体整合的病毒DNA不占主导地位. 因此更支持游离的病毒DNA为trRNA的转录模板.
　　表2顿挫型RNA在全长型RNA阴性(tr)和阳性(f+tr)母亲/新生儿血清中的表达（略）
　　不难理解，新生儿的HBV感染是由于暴露于受感染母亲体内的病毒所导致的宫内感染. 但是，这种感染不一定伴随高复制阶段. 这可能是由于前基因组RNA缺乏反转录起始位点，原因可能为转录和转录体成熟的相关因素与肝脏的发育程度有关［16］.
　　接受免疫阻断治疗的母亲所生新生儿普遍缺乏fRNA和病毒DNA(以及HBeAg)， 但trRNA阳性较为普遍. 这一方面反映了免疫阻断治疗可以有效预防新生儿的高复制性的感染. 另一方面，治疗组与非治疗组新生儿trRNA阳性率无明显差异，提示病毒感染本身并没有被有效预防. 如果新生儿血清trRNA是宫内感染的产物，我们推测病毒感染和表达的模式可能有两种：一种导致病毒的高复制，而另一种则检测不到病毒的复制. 前